soluble test의 프로토콜을 알려주세요.

Question

e.coli에서 단백질을 발현할때, target protein이 cell lysate의 sup에 있는지, pellet 에 있는지를 확인할때, soluble test를 한다고 하는데, 이 실험의 프로토콜을 조금 자세하게 알려주시면 감사할 것 같습니다.

실제로 실험실에서 실험해볼거라.. ㅎ

Answer 1

E. coli에서 단백질 발현 후 용해성 여부를 확인하는 soluble test는 세포를 수확하여 PBS 또는 적절한 완충용액으로 세척한 뒤 lysozyme과 protease inhibitor를 사용해 4°C에서 처리하고, 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄합니다. 이후 15,000~20,000 g로 4°C에서 15분간 원심분리하여 상등액(supernatant)과 침전물(pellet)을 분리하고, 각각 SDS-PAGE로 분석하여 target protein이 상등액에 있으면 용해성, 침전물에 있으면 불용성 inclusion body로 발현된 것을 확인합니다.

Answer 2

안녕하세요. 김채원 전문가입니다.

첫번째로 E coli를 배양하고

목표단백질을 발현시키기위한 IPTG같은 유도인자를 사용해줍니다.

이후 세포를 원심분리하여 배양액을 제거하고 펠렛을 모아서

PBS같은것으로 세척해줍니다

이후 세포 용해단계를 위해 lysis buffer를 통해 녹여주고

보통 트립신 EDTA 용액을 많이사용합니다.

이후 세포용해액을 원심분리하여 다시한번 펠렛을 분리해주고,

SDS-PAGE를 실시해서 단백질을 분리해줍니다.

상층액을 버리지는말고 상층액도 똑같이 단백질분리랄해서

단백질이 발현되었으면 수용성 단백질로 판정할수있고

침전물에서 단백질이 나타나면 불용성단백질로 판정할수있습니다.