안녕하세요. 이충흔 전문가입니다.
HPLC 분석 중에 발생하는 피크 갈라짐 현상은 원인이 워낙 다양해서 하나씩 소거법으로 접근하는 것이 좋습니다. 지금처럼 컬럼을 새것으로 바꾸고 이동상 비율도 고정한 상태라면 기계적인 결함보다는 화학적 평형이나 샘플 조제 조건에서 답을 찾을 확률이 높습니다.
가장 먼저 의심해볼 부분은 아세트알데하이드-DNPH 유도체 특유의 이성질체 현상입니다. 이 물질은 구조적으로 E형과 Z형이라는 두 가지 기하 이성질체가 존재하는데, 분석 조건에 따라 이 둘이 미세하게 분리되면서 피크가 두 개로 갈라지거나 어깨가 생긴 것처럼 보일 수 있습니다. 이럴 때는 컬럼 온도를 지금보다 5도에서 10도 정도 높여서 두 이성질체의 상호 전환 속도를 빠르게 해주면 피크가 하나로 예쁘게 합쳐지는 경우가 많습니다.
두 번째는 샘플을 녹인 용매의 농도 문제입니다. 만약 샘플을 100% 아세토나이트릴처럼 이동상보다 강한 용매에 녹여서 주입했다면, 컬럼 입구에서 샘플이 이동상과 섞이기 전에 일부가 먼저 밀려 나가며 피크가 찢어질 수 있습니다. 샘플 용매를 현재 이동상 비율인 60대 40에 맞추거나, 아니면 물 비중을 조금 더 높여서 주입해보시기 바랍니다.
마지막으로 유도체화 과정에서 반응이 불완전했거나 표준물질 자체가 변질되었을 가능성도 배제할 수 없습니다. 시약이 오래되었다면 반응 평형이 깨져서 부반응물이 생성될 수 있으므로, 번거로우시겠지만 새로운 표준품을 사용해 유도체화를 다시 진행하여 결과를 비교해보는 것이 가장 확실한 방법입니다. 가드 컬럼을 쓰고 계신다면 그것도 잠시 제거하고 테스트해보시는 것을 권장합니다.