클레나우절편은 어떻게 얻을 수 있으며 기능은 무엇인가요?
안녕하세요. DNA polymerase 1은 큰단위체와 소단위체로 구성된다고 하던데요 이때 클레나우절편은 어떻게 얻을 수 있으며 기능은 무엇인가요?
안녕하세요. 이상현 전문가입니다.
클레나우 절편에서 도메인만 선택적으로 제거한 단백질로, 주로 DNA합성 말단 수식에 사용됩니다.
생성방식은 단백질의 특정 부위를 트립신으로 절단하거나, 해당 도메일을 결실시킨 돌연변이로 발현하는 두가지가 전통적으로 쓰입니다.
감사합니다.
클레나우 절편은 DNA중합효소1의 큰 단편입니다.
DNA중합효소1에 단백질 분해 효소를 처리하여 얻습니다. 이 과정에서 효소의 단일 폴리펩타이드 사슬이 잘리며, 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성을 담당하는 작은 단편이 제거됩니다.
그리고 클레나우 절편은 5'->3' 중합효소 활성과 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성(교정 기능)의 두 가지 핵심 활성을 유지하는 기능을 합니다.
클레나우 절편은 E. coli DNA 중합효소 I을 서브틸리신으로 처리하여 얻는 큰 단위체입니다. 이 절편은 온전한 중합효소 I의 5' ->3' 중합효소 활성과 3' -> 5' 핵산분해효소 활성은 유지하지만, 5' -> 3' 핵산분해효소 활성이 제거된 형태입니다. 주로 DNA 이중 가닥 합성, 돌출 말단 채우기, 뭉툭한 말단 형성 및 방사성 DNA 프로브 제작 등 분자생물학적 DNA 조작에 사용됩니다.
안녕하세요.
DNA polymerase I은 원래 두 가지 절단 활성을 갖는 큰 효소아데요 5’→3’ 엑소뉴클레아제 활성과 3’→5’ 엑소뉴클레아제(교정) 활성, 5’→3’ 중합효소 활성 기능입니다. 이중에서 클레나우 절편은 5’→3’ 엑소뉴클레아제 영역이 제거된 형태입니다.
과거에는 프로테아제인 subtilisin으로 Pol I을 단백질 분해하면 아래와 같은 조각이 만들어졌습니다. 큰 단편(70 kDa)을 Klenow fragment이라고 하며 작은 단편(35 kDa)은 5’→3’ 엑소뉴클레아제 영역입니다. 즉, 원래의 Pol I을 부분적으로 단백질 분해하여 5’→3’ 절단 영역만 떼어내고, 나머지 중합효소 + 3’→5’ 교정 기능이 남아 있는 조각을 클레나우 절편이라 부르는 것입니다. 최근에는 실험에서 단백질 분해 대신 유전자 조작(변이 도입)을 통해 동일한 부분만 제거한 형태의 Klenow를 주로 사용하기도 합니다.
즉 클레나우 절편은 두 가지 특징적 능력만 유지한 Pol I의 변형체인데요, 5’→3’ 중합효소 활성 유지 기능을 가지며 DNA를 새로운 방향으로 합성할 수 있습니다. 또한3’→5’ 교정(exonuclease) 활성으로 잘못 붙은 뉴클레오타이드를 뒤로 돌아가 제거할 수 있으므로 합성 정확도가 높습니다. 반면에 5’→3’ 엑소뉴클레아제 없습니다. 따라서 DNA 앞쪽을 제거하면서 진행하는 능력은 없고 이 점 때문에 닉을 확장하는 nick translation 활동이 불가능합니다. 그래서 원래 Pol I과는 기능이 확실히 구분됩니다. 감사합니다.