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이온교환 크로마토그래피의 원리는 무엇인가요?
안녕하세요. 단백질의 특이 활성도를 높이기 위한 화학 분석법 중에서 이온 교환 크로마토그래피를 수행하면 굉장히 분석도가 높다고 알려져 있는데요. 이 이온 교환 크로마토그래피의 원리는 무엇인지 궁금합니다.
3개의 답변이 있어요!
안녕하세요.
이온교환 크로마토그래피는 분자의 순전하의 차이를 이용하여 혼합물 속 성분을 분리 및 정제하는 기법인데요, 특히 단백질, 펩타이드, 핵산처럼 표면에 전하를 띠는 생체분자의 분리에 좋습니다. 말씀해주신 것처럼 단백질 정제 과정에서 특이 활성도를 높이는 대표적인 단계 중 하나로 널리 사용되고 있는데요, 원리는 전하를 띤 고정상에 시료 분자들이 정전기적으로 결합하고, 결합 세기의 차이에 따라 서로 다른 시점에 떨어져 나오게 만드는 방법입니다.
크로마토그래피 컬럼 내부에는 다공성 비드 형태의 수지가 채워져 있습니다. 이 수지 표면에는 고정된 전하성 작용기가 붙어 있는데요, 수지가 카복실기와 같은 음전하 작용기를 가지고 있다면 양전하를 띠는 단백질을 붙잡게 되며, 이를 양이온 교환 크로마토그래피라고 합니다. 반대로 수지가 양전하 작용기를 가지면 음전하 단백질을 결합시키며, 이것은 음이온 교환 크로마토그래피라고 합니다. 이때 단백질이 어떤 전하를 띠는지는 용액의 pH와 단백질의 등전점에 의해 결정되는데요, 단백질은 아미노산 측쇄에 산성기와 염기성기를 가지고 있으므로 pH에 따라 양전하 또는 음전하를 띱니다. 일반적으로 용액의 pH가 단백질의 pI보다 낮으면 양전하가 많아지고, pH가 pI보다 높으면 음전하가 많아집니다. 즉 정제하려는 단백질의 pI를 알고 있으면 적절한 pH 조건을 설정하여 원하는 단백질만 컬럼에 결합시키도록 설계할 수 있습니다.
단백질 정제에서 특이 활성도가 높아진다는 말은, 전체 단백질 양 대비 원하는 효소의 활성 비율이 증가한다는 것인데요, 이온교환 크로마토그래피는 비슷한 크기의 단백질이라도 표면 전하 분포가 다르면 분리할 수 있습니다. 예를 들어 같은 세포 추출물 안에 수백 종의 단백질이 섞여 있어도, 목표 효소와 전하 특성이 다른 단백질들을 제거하면서 효소의 순도를 크게 높일 수 있습니다. 감사합니다.
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채택된 답변안녕하세요. 김찬우 전문가입니다.
이온교환 크로마토그래피는 IEC 라고 불리며 Ion-Exchange Chromatography 란 이름을 가지고 있습니다.
단백질이 가진 전하 특성을 사용하여 특정한 단백질을 분리하고 파악하는 기술 입니다.
장비의 원리는 정전기적 인력 입니다.
장비 안에는 단백질이 지나가는 길이 있고 그안에 작은 알갱이 들이 붙어 있습니다. 단백질이 이 알갱이들을 지나갈 때 알갱이들과 반대되는 단백질은 정전기적 인력에 의해 붙고 반대 인전하는 인력에 의해 통과를 하게 됩니다.
이후 달라붙은 단백질을 분리하기 위해 더 높은 인력을 가진 염이온을 활용하여 단백질을 때어내거나 pH 를 변화시켜 중성으로 만들어서 때어내기도 합니다.
그럼 답변 읽어주셔서 감사드립니다~! 더 궁금한게 있으시면 언제든지 문의 주십시요:)
안녕하세요. 이충흔 전문가입니다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질이 가진 전기적인 성질을 이용해 수많은 물질 속에서 원하는 성분만을 골라내는 기술입니다. 단백질은 저마다 고유한 전하를 띠고 있는데, 이 전하의 양과 종류가 다르다는 점에 착안하여 분리가 이루어집니다.
가장 먼저 준비해야 할 것은 전하를 띤 작은 알갱이들이 채워진 분리관입니다. 이 알갱이 표면에 음전하가 붙어 있으면 양이온 교환 수지가 되고, 반대로 양전하가 붙어 있으면 음이온 교환 수지가 됩니다. 단백질 혼합액을 이 관에 통과시키면, 알갱이와 반대되는 전하를 가진 단백질들은 전기적인 끌림에 의해 알갱이 표면에 달라붙게 됩니다. 반면 전하가 없거나 알갱이와 같은 전하를 띤 단백질들은 아무런 방해를 받지 않고 그대로 관을 빠져나가게 됩니다.
이렇게 특정 단백질이 알갱이에 붙어 있는 상태에서, 우리가 원하는 단백질을 다시 떼어내는 과정이 필요합니다. 이때 보통 소금물과 같은 염 용액의 농도를 서서히 높여주는 방식을 사용합니다. 용액 속의 염 이온들이 단백질이 붙어 있는 자리를 대신 차지하며 단백질을 밀어내게 되는데, 알갱이와의 결합력이 약한 단백질부터 순서대로 떨어져 나오게 됩니다.
결국 전기적인 힘의 세기에 따라 단백질이 나오는 순서가 결정되므로, 이를 통해 아주 유사한 구조를 가진 단백질들 사이에서도 우리가 목표로 하는 성분만을 정밀하게 분리해낼 수 있습니다. 이 과정에서 단백질의 입체적인 구조가 잘 유지되기 때문에, 분리 후에도 단백질 고유의 생물학적 활성을 높게 유지할 수 있다는 것이 이 분석법의 가장 큰 장점입니다.