얀핀셴의 실험에서 요소와 DTT에 처리 순서가 중요한 이유는 무엇인가요?
안녕하세요. 단백질의 3차구조 변성에 관련된 얀 핀셴의 실험에서 요소와 DTT를 처리하는 순서에 따라서 다시 3차 구조를 복원할 수 있는지의 유무가 결정되는 원리가 무엇인지 궁금합니다.
안녕하세요. 정준민 전문가입니다.
요소를 먼저 쓰면 수소결합이 풀려 단백질이 펄쳐지고, 이후 dtt가 이황화 결합을 환원해 올바른 접힘이 가능해진다빈다.
반대로 dtt를 먼저 쓰면 구조가 유지된 채 결합만 끊겨 잘못된 접힘이 굳어 복원이 어렵습니다.
단백질의 3차 구조를 복원하기 위해 요소와 DTT를 처리하는 순서가 중요한 이유는 단백질의 비공유 결합과 공유 결합의 복원 시점을 조절하기 위해서입니다. 요소와 DTT로 완전히 변성된 단백질을 올바르게 복원하려면 먼저 요소를 제거하여 비공유 결합에 의한 구조 형성을 유도한 뒤, 올바른 3차 구조가 형성된 상태에서 DTT를 제거하여 정확한 위치의 황화 결합이 형성되도록 해야 합니다. 만약 DTT를 먼저 제거하면, 단백질이 완전히 풀린 상태에서 무작위적인 황화 결합이 형성되어, 이후 요소를 제거해도 올바른 3차 구조로 돌아가지 못하고 엉킨 상태로 굳어지기 때문입니다.
안녕하세요. 이상현 전문가입니다.
얀핀센의 리보뉴클레이즈 실험에서 요소는 비공유적 상호작용을 파괴해서 단백질을 풀어내고
DTT는 이황화결합을 환원시킵니다.
요소를 DTT로 처리하면 먼저 3차구조가 풀린상태에서 이황화결합이 끊기기 때문에
잘못된구조에서 틀이 남지않고, 요소 제거 후 자연스럽게 올바른 접힘이 일어나서 기능회복이
가능합니다.
반대로 DTT, 요소 순서로하게되면 단백질이 여전히
부분적으로 접혀있는 상태에서 이황화결합이 무작위로 끊기게되기때문에
잘못된 재결합이 고정되어버려서 비가역적인 변성이 일어나게 됩니다.
감사합니다.
이미 질문에도 말씀하셨지만, 단백질이 자연적인 구조로 회복하는 과정에 영향을 미치기 때문입니다. 이 실험 자체가 단백질의 3차원 구조가 아미노산 서열에 의해 결정된다는 것을 보여주는 실험이기 때문이기도 하죠.
먼저 실험에서 요소는 단백질의 비공유 결합을 파괴하여 단백질을 변성시킵니다. 이로 인해 단백질은 무작위적인 코일 형태로 풀리게 됩니다. 그리고 DTT는 단백질 내의 이황화 결합을 환원시켜 끊어내는 역할을 합니다. 이황화 결합은 단백질의 안정적인 3차원 구조를 유지하는 데 중요한 공유 결합이죠.
그래서 올바른 순서, 즉 변성된 단백질(무작위적인 코일)을 DTT와 함께 투석하여 제거하면, 단백질은 자발적으로 원래의 3차원 구조로 접히면서 올바른 이황화 결합을 형성하게 됩니다.
반면 변성된 단백질 상태에서 DTT를 먼저 제거하면, 요소는 여전히 단백질을 무작위적인 코일 형태로 유지합니다. 이 상태에서 DTT가 없기 때문에 이황화 결합이 무작위적으로 형성되게 되고 이는 올바른 구조가 아닌 잘못 접힌 단백질을 만듭니다. 이후 요소를 제거하더라도 이미 잘못 형성된 이황화 결합 때문에 단백질은 원래의 활성 상태로 돌아갈 수 없는 상태가 됩니다.
안녕하세요.
네, 질문해주신 것과 같이 얀 핀셴의 실험은 리보뉴클레아제 A라는 효소를 가지고 단백질의 1차 구조인 아미노산 서열만으로도 올바른 3차 구조가 자발적으로 형성될 수 있음을 보여준 고전적인 연구인데요, 여기서 핵심은 요소(urea)와 DTT(dithiothreitol)의 처리 순서가 단백질의 올바른 재접힘에 결정적이라는 점입니다. 우선 요소는 단백질의 수소결합이나 소수성 상호작용과 같은 비공유적 상호작용을 파괴하여 3차 구조와 2차 구조를 풀어버리는데요 즉, 전체적으로 단백질이 변성된 상태를 만듭니다. 다음으로 DTT는 단백질 내의 이황화 결합(-S-S-)을 환원하여 끊어버리는데요, RNase A에는 여러 개의 시스테인 잔기가 있어 정상적으로는 정확한 쌍끼리 결합해야 하지만, 잘못된 조건에서 형성되면 비정상적인 이황화 결합이 생겨 단백질이 엉뚱하게 접힐 수 있습니다. 먼저 요소로 단백질의 비공유적 구조를 완전히 풀어주며 그러면 단백질은 선형 사슬 상태가 되고, 이 상태에서 DTT가 작용하면 모든 이황화 결합이 끊어집니다. 이후 요소를 제거하고 산화 조건(공기 중 등)을 제공하면, 단백질은 아미노산 서열의 정보에 따라 자발적으로 가장 안정한 3차 구조를 형성하면서 정확한 이황화 결합이 다시 형성됩니다. 반면에 먼저 DTT로 이황화 결합만 끊으면, 단백질은 여전히 부분적인 3차 구조와 2차 구조를 유지하고 있는데요, 이 상태에서는 자유 시스테인 잔기들이 잘못된 위치에서 서로 결합할 가능성이 높습니다. 따라서 그 후에 요소를 처리하더라도 이미 잘못된 다리가 걸려 있기 때문에 단백질이 다시 풀리지 않고 비정상적인 misfolded 상태에 갇히게 됩니다. 따라서 원래의 생물학적 활성을 가진 구조로 돌아가지 못하는 것입니다. 감사합니다.