gibson assembly cloning 시에 필요한 세가지 효소를 알려주세요.
gibson assembly method로 cloning을 할때 필요한 세가지 효소가 무엇인지, 각각의 효소의 역할과 기전을 설명해주세요.
안녕하세요. 김민선 전문가입니다.
Gibson assembly cloning 방법에는 exonuclease, DNA polymerase, DNA ligase가 필요합니다.
1. Exonuclease는 명칭에서 알 수 있듯이 뉴클레오타이드 말단(exo)을 자르는 역할을 합니다. 말단의 포스포디에스테르 결합을 깨는 가수분해가 일어납니다. 말단을 단일 가닥으로 만들어주기 때문에 다음 과정인 polymerase가 잘 붙을 수 있는 환경을 만들어 줍니다. 따라서 polymerase의 반응이 멈추지 않고 일어날 수 있도록 해줍니다.
2. DNA polymerase는 단일가닥의 DNA를 이중가닥으로 붙이는데 사용되며 exonulease에 의해 생긴 gap을 채우는 역할을 합니다.
3. DNA ligase는 gap을 채우면서 생긴 nick을 repair해주는 역할을 합니다. 따라서 이중가닥의 원형 plasmid를 product로 얻을 수 있도록 해줍니다.
안녕하세요. 손국현 전문가입니다.
오래되어 정확한지모르겠습니다.
gibson assembly cloning kit 은 insert(삽입할유전자)를 vector(삽입되어 운반할 유전자) 에 주입하여
E.coli 와 같은 숙주에 집어넣고 (Transformation) 이 유전자가 작동하여 해당 물질을 형성하는지 확인하는
일련의 과정을 손쉽게 진행할 수 있는 상업용 킷입니다.
유전자, DNA는 두가닥의 상보적 염기배열을 가지고 있습니다.
그렇기에 특정 유전자를 삽입시키기 위하여서는
우선 이 두가닥의 DNA를 잘라내어 서로 붙을 수 있게 배열을 짜야 합니다.
insert와 vector 둘다 잘라내야 하며 자를때 양 끝단이 말끔한게(Blunt) 아니라 한가닥이 길게 삐져나오게끔 (sticky ent) 잘라야 합니다.
T5 exonuclease 는 두 유전자 모두 잘라내어 양 끝단을 sticky 한 형태로 만들고 , 상보적으로 결합할 수 있게끔
작용합니다.
상보적결합으로 insert 와 vector 가 결합이 되면
Phusion polymerase 가 작동하며 비어있는 곳의 DNA를 연속으로 합성하여 줍니다.
3. 모든 염기서열이 합성되었지만, 1에서 절단면은 polymerase로 복구되지 않습니다. (Nick)
phosphodiester bond가 없기에 다른 효소가 필요합니다.
Taq DNA ligase 는 이 닉부분을 연결하여 온전한 클로닝이 되게끔합니다.
완성된 vector(insert)는 transformation 을 통해 E.coli에 주입되어지고 내부에서 특정 단백질이
발현된다면 성공한 실험입니다.
Gibson assembly cloning에 필요한 세 가지 효소는 T5 exonuclease, Phusion DNA polymerase, 그리고 Taq DNA ligase입니다. T5 exonuclease는 DNA 단편의 5' 말단을 분해하여 단일 가닥 오버행을 생성합니다. Phusion DNA polymerase는 상보적인 단일 가닥 영역을 채워 gap을 메웁니다. Taq DNA ligase는 남아있는 nick을 봉합하여 완전한 이중 가닥 DNA 분자를 형성합니다. 이 세 효소의 협력적인 작용으로 인해 여러 DNA 단편을 정확하고 효율적으로 조립할 수 있어 Gibson assembly가 가능해집니다.
Gibson Assembly는 다양한 DNA 단편들을 효율적으로 연결하는 강력한 클로닝 기법입니다.
이 기법의 핵심은 핵산외부가수분해효소, 중합효소, 리가아제 이 세 가지 효소의 연속적인 작용에 있습니다.
핵산외부가수분해효소(Exonuclease)
DNA 단편의 5 말단에서 몇 염기쌍을 절단하여 단일 가닥의 3 돌출 말단을 생성합니다.
이렇게 생성된 단일 가닥 말단들이 상보적인 서열을 가진 다른 DNA 단편과 쉽게 염기쌍을 형성할 수 있도록 해줍니다.
일반적으로 사용되는 핵산외부가수분해효소는 T5입니다.
중합효소(Polymerase)
핵산외부가수분해효소에 의해 생성된 단일 가닥 말단에 상보적인 서열을 가진 다른 DNA 단편과 염기쌍을 형성된 부분을 채워 넣어 이중 가닥 DNA를 생성합니다.
일반적으로 사용되는 중합효소는 Phusion polymerase입니다.
리가아제(Ligase)
중합효소에 의해 생성된 이중 가닥 DNA의 닉(nick) 부분을 연결하여 완전한 DNA 분자를 만듭니다.
일반적으로 사용되는 리가아제는 T4 DNA 리가아제입니다.
안녕하세요. 윤보섭 전문가입니다.
필요한 세 가지 효소는 T5 exonuclease, Phusion DNA polymerase, Taq DNA ligase 입니다.
T5 exonuclease는 DNA 조각의 5' 말단부를 제거하는 역할을 하며 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥 DNA를 분해하여 단일 가닥 돌출부를 만들어냅니다.
Phusion DNA polymerase는 DNA 가닥을 연장하는 역할을 하며 상보적인 단일 가닥 영역을 주형으로 새로운 DNA를 합성합니다.
마지막으로 Taq DNA ligase는 DNA 가닥을 연결하는 역할이며 인접한 DNA 조각 사이의 nick 부분을 봉합하여 연속적인 형태의 DNA 가닥을 만듭니다.
이 세 가지 효소들이 함께 깁슨 어셈블리의 주 단계인 말단 제거, DNA 연장 및 연결 과정을 수행하는 것입니다.
안녕하세요.
Gibson assembly cloning은 합성 생물학 회사인 Telesis Bio의 최고 기술 책임자이자 공동 창업자인 Gibson의 이름을 따서 명명된, 단일 등온 반응으로 여러 DNA 단편을 결합할 수 있는 분자 복제 방법을 말합니다. 깁슨 어셈블리 master mix는 세 가지 서로 다른 효소가 포함되어 있는데요, 각각 T5 exonuclease, DNA polymerase, DNA ligase입니다. T5 exonuclease는 5'→3' 방향으로 DNA의 단일 가닥을 잘라내는 효소인데요, DNA 조각의 5' 말단에서 뉴클레오타이드를 제거하여 단일 가닥의 오버행(지속적으로 남아있는 DNA 서열)을 생성합니다. DNA polymerase는 DNA 합성 효소로, 3' 말단에서 새로운 뉴클레오타이드를 추가하여 DNA의 간극을 채우는 역할을 합니다. 마지막으로 DNA ligase는 DNA 조각 간의 인산-당 결합을 형성하여 두 조각을 연결하는 효소입니다. 이 효소는 DNA의 3' OH와 5' phosphate 그룹 사이의 결합을 형성하여, 두 조각이 안정적으로 결합되도록 돕습니다.